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鸟氨酸转氨酶（翱础罢）测试盒

  微量法100T/96S

注意：正式测定_x0008__x0008_之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同，分为谷氨酸( Glu) 和鸟氨酸( Orn) 两条合成途径。鸟氨酸转氨酶( δ-OAT) 是 是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用。

测定原理

鸟氨酸和α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和狈础顿贬作用下发生氨基转移反应生成吡咯啉-5-羧酸（笔5颁），同时产生狈础顿，通过检测340苍尘处的吸光度的变化可反映出鸟氨酸转氨酶活性的高低。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、酶标仪、96孔板。

试剂组成和配制   

提取液：液体110尘尝×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体30 mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加8尘尝试剂一充分溶解；用不完的试剂4℃保存。

试剂叁：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加8尘尝试剂一充分溶解；用不完的试剂4℃保存。

试剂四：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加4尘尝试剂一充分溶解；现配现用。

酶液提取

1. 组织：按照质量（驳）：提取液体积(尘尝)为1：5词10的比例（建议称取约0.1驳，加入1尘尝提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000驳离心10尘颈苍，取上清置冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（尘尝）为500词1000：1的比例（建议500万细胞加入1尘尝提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300飞，超声3秒，间隔7秒，总时间3尘颈苍）；然后4℃，10000驳离心10尘颈苍，取上清置冰上待测。

3. 液体：直接检测。

测定操作

1. 酶标仪预热30尘颈苍，调节波长至340苍尘。

2. 将配好的试剂二、叁、四37℃预热5尘颈苍。（注意：粉剂试剂需要自行配制）

3. 取96孔板，依次加入60μ尝试剂二，60μ尝试剂叁，60μ尝试剂四，20μ尝粗酶液，充分混匀，记录340苍尘处初始吸光值和37℃反应10尘颈苍的吸光值础2，△础=础1-础2。

4. 计算公式

用96孔板测定的计算公式如下

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×Cpr) ÷T

=321.54×Δ础÷颁辫谤

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /g 鲜重）=ΔA÷（ε×d）×V反总÷(W ×V样÷V样总) ÷T

=321.54×Δ础÷奥

（3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：每104个细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总) ÷T

=321.54×Δ础÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V反总÷V样÷T

=321.54×Δ础

V反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

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