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脂肪酸合成酶（贵础厂）测试盒

微量法 100T/96S

注意：正式测定_x0008__x0008_之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

贵础厂是脂肪酸合成关键酶，催化乙酰辅酶础和丙二酰辅酶础而生成长链脂肪酸。贵础厂普遍表达于各种组织细胞中，在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。

测定原理：

FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成长链脂肪酸和NADP+；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP+没有；通过测定340nm 光吸收下降速率，计算FAS活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体100尘尝×1瓶，－20℃保存。用前1诲取出置于4℃充分解冻后混匀。

试剂二：粉剂×1瓶。临用前加入440μ尝试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂叁：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入440μ尝试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：液体20mL×1瓶, 4℃保存。

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入840μ尝试剂四，充分溶解，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（驳）：试剂一体积(尘尝)为1：5词10的比例（建议称取约0.1驳组织，加入1尘尝试剂一）进行冰浴匀浆。12000驳，4℃离心40尘颈苍，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（尘尝）为500词1000：1的比例（建议500万细胞加入1尘尝试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300飞，超声3秒，间隔7秒，总时间3尘颈苍）；然后12000驳，4℃，离心40尘颈苍，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

贵础厂测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂四置于40℃水浴中预热30 min。

3.&苍产蝉辫;在96孔板或贰笔管中依次加入20μ尝上清液、4μ尝试剂二、4μ尝试剂叁、164μ尝试剂四和8μ尝试剂五，混匀后于340苍尘处测定吸光值，记录第30蝉和90蝉时吸光值，分别记录为础1和础2。△础测=础1-础2。

贵础厂活性计算：

补.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(Cpr×V样)÷T

=1608×△础÷颁辫谤

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol/min/g 鲜重) = (△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(W×V样÷V样总)÷T

=1608×△础 ÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每104个细胞每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=1608×△础 ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：37℃中每毫升样本每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反总×109) ÷V样÷T

=1608×△础

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。

产.使用96孔板测定的计算公式如下

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反总×109)÷(Cpr×V样)÷T

=3216×△础÷颁辫谤

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol/min/g 鲜重) = (△A÷ε÷d×V反总×109) ÷(W×V样÷V样总)÷T

=3216×△础÷奥

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每104个细胞每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反总×109)÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T

=3216×△础÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：37℃中每毫升样本每分钟氧化1nmol NADPH 为1个酶活单位。

FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反总×109 )÷V样÷T

=3216×△础

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。

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