麻花星空无限mv

药物抗体比 (DAR)和药物载量或 DAR 分布是 ADC 的两个主要关键特性。 DAR值定义为与抗体缀合的药物分子的平均数量。相反，药物负载或 DAR 分布定义为抗体载体上存在的缀合药物数量的化学计量分布。 DAR 值决定了 ADC 的功效和安全性。高 DAR 可能会阻碍 ADC 的药代动力学特性，而低 DAR 会显着限制这些疗法的效力。理想情况下，DAR 分布值应在 2-4 _x0008__x0008_之间。

已经开发了几种方法来以越来越高的精度测量这些特性。然而，这些系统固有的异质性以及抗体载体中复杂的翻译后修饰的存在使得这种表征在分析上具有挑战性。

目前，这些属性是使用以下方法测量的：

• 药物与抗体的比率（平均DAR）：

• 紫外可见 (UV/Vis) 光谱

• 组织蛋白酶-叠酶切法

• 载药量分布：

• 毛细管电泳（颁贰）

• 关键属性：

• 疏水相互作用色谱 (HIC)

• 反相高效液相色谱（搁笔-贬笔尝颁）

• 质谱（惭厂）

用于 DAR 测定的紫外-可见 (UV/VIS) 光谱

紫外/可见光谱是用于 ADC 表征的方法。该方法传统上用于确定蛋白质浓度，它依赖于测量不同波长 (λ) 下的吸光度。该方法的先决条件是：（i）有效负载必须具有紫外/可见发色团； (ii) 抗体和有效负载应具有特点的最大吸光度波长（λ最大值，前者通常为 280 nm）； (iii) 药物不得干扰抗体的吸收光谱，反_x0008__x0008_之亦然。

如果 ADC 符合所有先决条件，则可以根据吸光度值和消光系数计算两种组分的浓度。随后，平均 DAR 可以简单地通过将平均药物浓度除以平均抗体浓度来估计。

尽管这种方法通常用于估计 ADC 的 DAR，但它存在重要的局限性。例如，ADC 样品中游离药物的存在可能导致 DAR 值的高估。此外，紫外/可见光谱不提供任何有关药物负载分布的信息，而药物负载分布是一个同样重要的特性。因此，该方法保留用于常规质量控制操作，并且在新 ADC 的早期开发过程中很少使用。

用于 DAR 测定的组织蛋白酶 B 酶切法

组织蛋白酶 B 是一种溶酶体酶，负责用肽接头切割 ADC 构建体。最近开发了基于组织蛋白酶 B 的 DAR 测定酶法。该方法涉及使用多种酶和还原剂进行一系列处理，以允许结合药物的释放。随后通过色谱分离对处理后的游离药物进行定量。

ADC 首先用IdeS 蛋白酶预处理，产生 F(ab')2 和 Fc 片段，然后用2-巯基乙胺(2-MEA) 还原，以进一步裂解为 Fd?、Fc 和 Lc。这种复杂的预处理可确保更好地进入结合位点并更有效地切割有效负载。在这些步骤_x0008__x0008_之后，用组织蛋白酶 B进行消化，然后通过 RP-HPLC-UV 进行蛋白质组分的分离。

由于两种组分在药物定量_x0008__x0008_之前被分离，因此该方法克服了 UV/Vis 方法所施加的最常见限制 -药物和抗体组分需要不同的 λ 最大值。此外，这种方法也被认为比质谱法更精确，质谱法的质量信号通常会受到疏水性和净蛋白质电荷的影响，而疏水相互作用色谱 (HIC)在分析随机缀合的 ADC 时可能会受到分辨率效率低的影响。

基于组织蛋白酶 B 的方法最重要的限制是无法辨别药物负载分布。此外，由于该方法的复杂性，其用于质量控制目的的实施仍然具有挑战性。因此，该方法在早期开发或抗体研究环境中仍然更有用。

用于药物载量分布测定的毛细管电泳 (CE)

毛细管电泳（颁贰）具有仪器简单、规格小型化、分离高效快速、进样量少、分辨率高等特点。已经测试并实施了不同的 CE 方法来表征 ADC，包括毛细管凝胶电泳 (CE-SDS)、毛细管等电聚焦 (cIEF)、成像 cIEF (iCIEF)、毛细管区带电泳 (CZE) 和毛细管电泳-质谱法 ( CE-MS）。所有这些方法都为 ADC 提供了不同级别的表征，例如异构体、乙二醇分析和翻译后修饰等。

与基于组织蛋白酶 B 的方法一样，CE 方法也是最近才开发出来的。因此，很少有文献可以支持他们。然而，在这些方法中，iCIEF 始终取得了有希望的结果。该技术允许根据 ADC 电荷变体的等电点 (pI) 对其进行分离。通过这种方式，可以有效分离未结合的抗体和具有不同载药量的不同 ADC 种类，有助于监测批次间的一致性、载药量分布和未结合的抗体。其缺点是该技术仅在基于赖氨酸的缀合 ADC 上进行了测试。因此，目前尚不清楚它是否可以应用于其他共轭化学。

用于详细 DAR 分析的疏水相互作用色谱 (HIC)

疏水相互作用色谱 (HIC) 的工作原理是在疏水固定相上运行反盐梯度。固定相根据样品成分的疏水性保留和分离样品成分，并且由于该方法使用温和的条件，因此在分析过程中保留了复杂蛋白质种类的天然构象。因此，HIC 方法可用于测量平均 DAR并确定ADC 中的药物负载分布。

在分析非共价蛋白缀合物（例如半胱氨酸连接的 ADC）时，温和条件的使用使得该技术极其方便。这些缀合物通常在 RPLC（反相液相色谱）等更严格的色谱方法中解离，使得 HIC 成为这些生物药物详细 DAR 分析的参考技术。

HIC 技术在分析基于赖氨酸和位点特异性的缀合 ADC 时效率相当低。此外，该技术分离未结合分子的能力仍然有限，因为这些物质仅被部分解析。然而，由于最近开发了新的色谱柱和分离方案，HIC 仍然是半胱氨酸连接 ADC药物载量分布分析的黄金标准。

用于详细 DAR 分析的反相高效液相色谱 (RP-HPLC)

反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 广泛用于表征药物蛋白质。与基于 HIC 的表征相比，RP-HPLC 的优点是由于流动相的挥发性，该方法与质谱法的兼容性。相比_x0008__x0008_之下，HIC 使用与 MS 研究不相容的盐梯度。 RP-HPLC 或简称 RPLC（反相液相色谱）作为分析平均 DAR、载药量分布、未缀合抗体和游离药物接头种类的方法有着成功的记录。

对于半胱氨酸连接的 ADC，RPLC 是 HIC 的最合适替代品，可用于详细的 DAR 分析。然而，该方法的主要缺点_x0008__x0008_之一源自已知会破坏半胱氨酸连接的 ADC 天然构象的恶劣分析条件，通常导致轻链和重链解离。为了克服这一限制，ADC 通常在分析前用还原剂进行预处理。在这种情况下，轻链和重链更容易分离和单独评估。或者，ADC 也可以用 IdeS 进行预处理并进行化学还原以生成 Fc、LC 和 Fd 片段。

无论 RPLC 中 ADC 分析所用的方案如何，寻找合适的色谱条件仍然具有挑战性。对于赖氨酸连接的 ADC，RPLC 分离提供的分辨率通常不足以区分具有不同载药量的完整 DAR 种类。因此，该方法对于平均 DAR 测定有效，但在分析赖氨酸连接 ADC 中的药物负载分布时具有挑战性。相比_x0008__x0008_之下，位点特异性缀合 ADC 可以通过 HPLC 或基于 HIC 的方法轻松分析。

一般来说，独立于缀合化学（半胱氨酸、赖氨酸或位点特异性），RPLC 可以作为平均 DAR 质量控制的可靠方法，并且对于检测杂质的存在非常有用。此外，RPLC 方法可用于估计 ADC 稳定性并量化游离药物分子，使其可用于新型 ADC 的广泛早期表征及其生产工艺的优化。

用于详细 DAR 分析的质谱 (MS)

质谱 (MS) 分析取决于分析物的电离效率，并包含多种强大的高分辨率技术。目前用于分析大生物分子的 MS 光谱仪使用电喷雾电离 (ESI)结合飞行时间 (TOF)或Orbitrap，这有助于不同 ADC 物种在还原或非还原条件下获得高分辨率。

由于这些方法的敏感性，通常建议用 PNGase F 预处理 ADC，以消除 N-聚糖引起的异质性，N-聚糖通常会掩盖或干扰 MS 分析。流行的替代方案包括将 ADC 还原为重链和轻链、抗体载体的酶促片段化或两者的组合。此外，对于通常电离效率特别低的赖氨酸连接的 ADC，研究人员已成功去除有效负载的疏水部分，成功提高了检测灵敏度。

预处理通常可以对 ADC 进行更详细的结构分析，包括以高精度和灵敏度检测低丰度 ADC 物种。

结束语

本文涵盖的所有不同方法都应被视为互补的。事实上，使用不同方法获得的结果的比较有助于在平均 DAR、药物负载分布、未缀合抗体含量和游离有效负载连接体含量方面获得更准确的 ADC 分子指纹。此外，大多数这些技术的性能和准确性在很大程度上取决于共轭化学。因此，在早期开发过程中应使用多种方法来确保这些生物药物的正确和广泛的表征。

尽管基于质谱的方法在分辨率方面仍然是好的，但将其用于常规质量控制通常并不可行。因此，通常应选 HIC 或 CE 等替代方法来加快 ADC 生产和质量控制。